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气相色谱-质谱联用技术对急性肝损伤的代谢物及

导读:采用北分瑞利集团设备做气相-质谱(GC-MS)联用技术探究四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝损伤后肝组织代谢物的变化,筛选相关代谢通路。基于 GC-MS 的代谢组学技术可用于急性肝损伤小


返回列表 来源:未知 发布日期:2019-10-30 16:40【
急性肝损伤是引起肝癌、肝硬化的重要因素,CCl4是经典的肝 损伤模型之一 ,其损伤肝细胞的主要机制是通过强氧化性的自由 基及脂质过氧化物产生,造成肝脏组织损伤。如何从代谢组学角度 研究 CCl4导致急性肝损伤的作用机制,发现致毒标志物将有助于对这 一经典肝毒性物质的中毒机理的认识。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
仪器:北分瑞利液质联用仪、 N2吹仪、KQ-500DE 型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)、HH-S4 恒 温水浴锅(金坛市医疗仪器厂),低温离心机(Thermo Fisher Scientific)、HV-3 静音无油空压机(济南浩伟实验仪器有限公司)。 试剂:甲氧胺盐酸盐、N-甲基-(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺(MSTFA) 和三甲基一氯硅烷(TMCS),分析纯(购自美国 Sigma 公司)、十七 烷酸(美国 SIGMA 公司);甲醇,乙腈(Fisher chemicals 公司), 色谱纯;吡啶(天津市大茂化学试剂厂,生产批号:20150612),分析纯;实验用水取自实验室超纯水。

1.2 实验动物及分组
SPF 级雄性昆明种小鼠,体重(20.0±2.0)g,由新疆自治区 新疆医科大学动物中心提供,所有动物饲养均按照国家动物实验规定 执行。将适宜喂养的 20 只小鼠随机分为对照组和 CCl4模型组,每组 10 只。对照组和 CCl4模型组小鼠适应性灌胃生理盐水 0.5 ml 3 d 后, 模型组腹腔注射 0.1%的 CCl4橄榄油溶液 10 ml/kg,正常对照组腹腔 注射生理盐水橄榄油溶液 10 ml/kg。小鼠于造模后禁食不禁水 12 h 后,立即将小鼠断颈处死,快速取出完整肝脏,生理盐水洗尽残血、 除去结缔组织、滤纸拭干,称重;准确称取 0.50 g 肝脏,按 1:9(g: ml)加入 0.90%的冰生理盐水,冰浴下手动匀浆,4000 r/min 离心 5 min,分离得到 10%的肝匀浆上清液,置入-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.3 肝组织病理切片
取小鼠左叶相同位置肝组织,用 4℃生理盐水冲尽残血,滤纸拭干, 10%中性甲醛固定,石蜡包埋,切片,苏木精-伊红(HE)染色,光镜 下观察肝组织切片的病理形态学变化。

2 结果
2.1 CCl4急性肝损伤模型病理变化
采用 HE 染色与正常组小鼠肝组织病理切片比较,CCl4 模型组小鼠的肝细胞排列紊乱,部分肝细胞内见大小不等的脂滴空 泡,另有部分区域小叶内肝细胞点状、灶状滑丝,伴有碎片状 LC 浸润,肝中央静脉及肝血窦充血,坏死灶区有较多淋巴细胞浸润。

2.2 GC-MS 结果分析
10 个通过模式识别筛选出的 差异代谢物导入 metaboanalyst 3.0 网站进行代谢通路分析得到的结 果。可知 CCL4 造模后主要对机体的甲硫氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、 嘌呤代谢等代谢通路产生影响。

3 讨论
北京北分瑞利分析仪器研究采用 GC-MS 技术对 CCL4 所致急性肝损伤小鼠进行肝组织 的代谢组学研究。采用 PLS-DA 等多元分析模式识别方法及传统的 SPSS 17.0 统计进行分析,共筛选出 5 个生物标志物,分别是酪氨酸、 葡萄糖、葡萄糖醛酰胺、麦角固醇、腺嘌呤。经 metaboanalyst 3.0 数据分析,CCL4所致急性肝损伤小鼠主要对机体的甲硫氨酸代谢、苯 丙氨酸代谢、嘌呤代谢等代谢通路产生影响。 四氯化碳是一种经典的肝毒药物,从代谢组学角度找出一些具有 特异性变化规律的代谢物,全面揭示其生物效应。小鼠经 CCL4 造模后,肝组织切片表明其肝细胞明显坏死,对肝脏组织中的代谢物查找 发现其肝脏组织损伤主要表现在能量供给阻碍,以及氨基酸代谢紊乱, 小鼠肝细胞循环受到显著抑制,并且由于脂蛋白合成受阻,是脂肪酸 从肝脏到血浆的分泌和转运机能明显下降。特别是肝组织中酪氨酸物 质含量下降,这种结果很可能是由于氨基酸在肝脏的转运收到阻碍, 因此其相互转化受阻,其直接的表现即是参与机体能量代谢的相关通 路和循环比如苯丙氨酸代谢通路及三羧酸循环收到抑制,进而引发一 系列的级联反映,最终表现出肝衰竭的相应表征。

本研究成功地将代谢组学分析方法引入急性肝损伤的研究中,并 通过在线数据库分析的影响肝脏病理变化的相关代谢通路,为深入探 讨急性肝损伤模型的作用机制奠定了一定的实验基础。