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北分瑞利液相色谱法基于淡豆豉6种黄酮类成分质

导读:建立同时测定淡豆豉中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素含量的方法。方法 采用高效液相色谱法。采用 Phenomenex Luna C18色谱柱( 4.6 mm×250 mm,5 μm) ,流动相


返回列表 来源:未知 发布日期:2019-10-29 16:09【
淡豆豉是以豆科植物大豆[Glycine max ( L.) Merr.]为主料,以桑叶、青蒿为辅料经过发酵加工而 成的制品。性苦、辛,凉。归肺、胃经。中医理论认 为淡豆豉具有解表,除烦,宣发郁热的功效,可用于 感冒,寒热头痛,烦躁胸闷,虚烦不眠的症状。淡 豆豉主要活性成分为黄酮、皂苷、蛋白、多糖、氨基 酸、纤溶酶和挥发性等化合物。
淡豆豉中的黄酮类成分被认 为是其主要活性成分,其分为游离型苷元和结合型 糖苷两类,本试验对市场上购买及企业收集的淡豆 豉的 6 种黄酮类成分的含量进行比较,建立能同时 测定其中多种指标成分的方法,对于其质量控制和 确保疗效具有重要的意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器
1260 型高效液相色谱仪( 美国 Angilent 公司) ; CPA225D 型十万分之一分析天平( 德国 Sartorius 公司) ; KQ-500E 台式超声波清洗器( 昆山市 超声 仪 器 有 限 公 司) ; Milli - Q 超 纯 水 仪 ( 美 国 Millipore 公司) 。

1. 2 试 药
对照品大豆苷( 批 号: MUST - 16031507) 、黄豆黄苷( 批号: MUST- 17032503) ,染 料木苷( 批号: MUST-16021802) 、大豆苷元( 批号: MUST - 17101202 ) 、黄 豆 黄 素 ( 批 号: MUST - 17092210) 、染料木素( 批号: MUST-15090908) 均购 自成都曼思特生物科技有限公司,以上标准品纯度 均大于 98%。淡豆豉样品( 编号为 S1 ~ S13) 和淡豆 豉原料黑豆( 编号为 S14) 分别在市场和企业中收 集,S1~ S14 信息。甲醇、乙腈为色谱纯( 德 国 Merck 公司) ; 甲酸为色谱纯( 上海阿拉丁试剂有 限公司) ,其余试剂均为分析纯。


2 方法与结果
2.1 色谱条件 采用 Phenomenex Luna C18色谱柱 ( 4.6 mm×250 mm,5 μm) ,流动相甲醇( A) -0.1%甲酸水溶液( B) ,梯度洗脱( 0~ 5 min,5% ~ 5% A; 5 ~ 8 min,5% ~ 30% A; 8 ~ 15 min,30% ~ 40% A; 15 ~ 20 min,40% ~60% A; 20~30 min,60% ~ 70% A; 30 ~ 33 min,70% ~5% A; 33 ~ 38 min,5% ~ 5% A) ,柱温 30 ℃,流速 0. 8 mL·min-1 ,进样量 10 μL,检测波长 254 nm。在此色谱条件下 6 种对照品理论板数均大 于 5 000,色谱峰对称性良好。

2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密取大豆苷、黄 豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素 对照品适量,精密称定,加入甲醇超声溶解,制成质 量浓度分别为 1. 056、1. 112、0. 968、1. 024、0. 134 和 1.024 mg·mL-1 的单一对照品储备液,备用。分别 精密量取上述对照品溶液适量,置同一容量瓶中,加 入 50%甲醇至刻度,即得大豆苷 52.8 μg·mL-1 、黄 豆黄苷 55.6 μg·mL-1 、染料木苷 48.4 μg·mL-1 、大 豆苷元 51.2 μg·mL-1 、黄豆黄素 53.6 μg·mL-1 和 染料木素 51.2 μg·mL-1 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取淡豆豉粉末约 2 g, 精密称定,置具塞三角瓶中,精密加入甲醇 25 mL, 密塞,称定重量,超声处理 30 min( 功率 250 W,频率 50 kHz) ,放冷,再次称重,甲醇补足减失重,摇匀, 0.22 μm 滤膜滤过,取续滤液,得供试品溶液。

3 讨论
检测波长的选择,通过对 6 种分析物进行 DAD 全波长扫描,大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷 元、黄豆黄素和染料木素的最大吸收波长分别为 250、258、260、248、257、260 nm,综合 6 种黄酮类成 分在 254 nm 处均有良好的紫外吸收。因此,选择 254 nm 作为检测波长。 流动相选择,分别比较了甲醇-水、甲醇-0.1% 甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液系统 及其不同比例梯度洗脱效果,结果发现用乙腈-水 和乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱时,黄豆黄苷不 能出峰,其他色谱峰重叠,而用甲醇-水梯度洗脱 时,6 种成分峰形不佳,改用甲醇-0.1%甲酸水溶液 洗脱时,6 种成分的分离效果明显改善,且峰形较 好,基线稳定。故最后采用甲醇-0.1%甲酸水溶液 作为色谱流动相。
通过分析方法学的验证,本试验验证了该方法 的精密度、稳定性、重复性、线性范围和加样回收率 等均符合分析要求。最后通过对不同来源样品的含 量测定,结果表明,市场上收集淡豆豉的成品与企业 生产的相比,其黄酮类成分含量普遍偏低,这可能市 场上销售的部分淡豆豉可能省略了再闷过程,从而 使产品质量较差。且不同来源淡豆豉黄酮类单体成 分的含量差别也较大,推测与药材的生长环境、炮制 加工方法的不同有关。此外,通过对福建咸康药业 有限公司收集的原料黑豆和淡豆豉成品研究发现, 淡豆豉中苷元成分的含量显著增加,糖苷成分明显 减少,提示淡豆豉的炮制存在由苷向苷元转化的过 程。说明大豆经炮制后,糖苷配基解离,得到游离型 的苷元,其生理活性增强,从而使淡豆豉的药用价值 得到充分体现。 根据耐用性试验要求,我们针对其进行了不同 品牌色谱柱、不同流动相 pH、不同流速及不同柱温 的考察。结果表明,不同色谱条件下 6 种分析物的 含量具有良好的重现性,RSD 小于 1%。色谱条件 在一定范围内变化对试验结果影响较小,表明方法 耐用性良好。

综上 所 述,本试验所建立的高效液相色谱 ( HPLC) 法同时测定淡豆豉中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料 木素含量的方法操作简便、稳定、准确且可行,可以 为淡豆豉质控的提升提供参考,进一步为淡豆豉的 炮制化学、炮制发酵机制和发酵产物的活性评价奠 定基础。