北分瑞利

服务热线:021-58201756
17621554455

他们都在找: WQF-600N傅立叶变换近红外光
当前位置主页 > 新闻动态 > 行业动态 >

超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中糠氨酸的

导读:采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了检测牛奶中糠氨酸含量的分析方法。试样经10.6 mol/L 盐酸水解,纯水稀释后,糠氨酸在C18色谱柱上以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相,进行液相色谱


返回列表 来源:未知 发布日期:2019-10-25 14:20【
糠氨酸(Furosine,ε-N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸)又名呋喃素,分子式为C12H18N2O4,是结构与氨基酸类似的 赖氨酸衍生物,是蛋白质与乳糖在热处理过程中经美拉德反应的特征产物之一。加热温度和时间是影响牛奶中糠 氨酸含量的两个重要因素,在储存过程中也会导致糠氨酸含量增加,因此国际上常用糠氨酸作为热处理和储 存对乳制品质量影响的重要评估指标。同时,研究发现牛奶中糠氨酸含量和乳果糖指标相结合,可用于鉴别液 态奶制品中是否含有复原乳。

北分瑞利借鉴NY/T 939-2016方法对牛奶中糠氨酸进行前处理,水解液经纯水稀释后用UPLC-MS/MS测定。该 方法前处理过程简便、灵敏度高、分析时间短、抗干扰能力强,适用于大批量牛奶样品中糠氨酸含量的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂
北分瑞利型超高效液相色谱仪;XEVO TQ-MS 三重四级杆质谱仪(Waters 公司);20 mL 带螺盖耐热水解试管(KIMBLE 公司);涡旋混合器(IKA 公司)。 糠氨酸(纯度≥99%,Polypeptide 公司);HCl、乙腈、甲酸(色谱纯,Fisher 公司);实验用水为 Millipore 纯水仪制备。

1.2 糠氨酸标准储备液的配制
称取一定量的糠氨酸标准品,用 3 mol/L HCl 配制成质量浓度为 200 ug/mL 标准储备液,于-20℃冰箱保存(可 贮存 24 个月);使用时用 0.1mol/L HCl 逐级稀释成所需浓度的标准工作液。

1.3 样品前处理
用移液管吸取 2.00 mL 牛奶试样,置于 20 mL 耐热水解试管中,加入 6.00 mL 10.6 mol/L HCl 溶液,涡旋混 匀。于干燥箱中 110℃下加热水解 12~23h。加热约 1h 后,轻轻摇动试管。加热结束后,将试管从干燥箱中取出, 冷却至室温后用滤纸过滤,滤液待进一步处理。
a)对于巴氏杀菌乳:吸取 1.00 mL 试样水解液,加入 5.00 mL 纯水,混匀,过 0.22 µm 水系微孔滤膜后得到 上机液,供 UPLC-MS/MS 分析测定;
b)对于 UHT 高温灭菌乳:由于其糠氨酸含量较高,需将 1.3.2 a)中的上机液稀释 10 倍后再供 UPLC-MS/MS 分析测定。

1.4 液相色谱及质谱条件
液相色谱:色谱柱:Waters BEH C18(1.7 µm,50 mm×2.1 mm);柱温:40℃;流速:0.4 mL/min;进样量: 1 µL;流动相 A:乙腈;流动相 B:0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脱程序:0~0.8 min,3% A;0.8~1. 0 min,3%~100% A;1. 0 ~2. 0 min,100%A,2 ~2.1 min,100% A~3% A,2.1 ~3.0 min 3% A。
质谱:离子源:电喷雾离子源( ESI + ) ;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测( MRM);毛细管 电压:3.2 kV;离子源温度:150℃;去溶剂气温度:500℃;去溶剂气流量:1000 L /h;锥孔电压:30 V;定性 离子对 255.1—192.1,碰撞能量 18 V;定量离子对 255.1—84.1,碰撞能量 27 V。

2 结果与讨论

2.1 色谱及质谱条件的优化
流动相的选择:对比了酸性体系(0.1%甲酸水溶液)与非酸性体系(纯水、乙酸铵溶液)分别与甲醇、乙 腈的流动相体系组合,结果发现目标物在酸性体系中比非酸性体系峰形更加对称,分离效果更好;由于牛奶水解 液中仍含有少量的糖、脂肪等杂质可能会残留在色谱柱上,影响色谱柱的使用寿命,而乙腈比甲醇体系洗脱能力 更强,可以有效去这些杂质。综合考虑目标物信号强度、色谱分离效果以及除杂等因素,本研究采用 0.1%甲酸 水溶液+乙腈流动相体系。

2.2 质谱法(UPLC-MS/MS)与色谱法(HPLC、UPLC)的比较
农业部行业标准NY/T 939-2016 [6]中规定的糠氨酸检测方法为HPLC和UPLC法。对从超市采购的品牌样品 (包括巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳)采用1.3前处理步骤,其上机液分别采用UPLC-MS/MS和UPLC法检测,结果表明两种仪器测定的糠氨酸含量基本一致。

2.3 线性范围和定量限
吸取不同体积的糠氨酸标准储备液,用 0.1 mol/L HCl 分别配置 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 的糠氨酸上机标准溶 液,以各自定量离子的峰面积为 Y 对应质量浓度 X(mg/L)做标准曲线,得到的线性方程和相关系数。结果表明, 糠氨酸标准溶液在 0.01~0.5 mg/L 浓度范围内线性良好,线性方程为 Y=76338x+85.182,相关系数 R 2为 0.9996。以 10 倍信噪比(S/N)计算,糠氨酸上机液最低定量浓度为 0.0025 mg/L,通过公式(1)计算得到糠氨酸的质量分 数,最终确定本方法糠氨酸的定量限(LOQ)为 0.5 mg/100g 蛋白。

3 结 论

建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定牛奶中糠氨酸含量的分析方法。该方法灵敏度高, 糠氨酸定量限(LOQ)达到 0.5 mg/100g 蛋白,能满足生牛乳、巴氏杀菌乳及 UHT 高温灭菌乳等不同样品中糠 氨酸含量的检测。同时该方法具有较高的准确度和精密度,前处理步骤简单,分析速度快,可有效避免由于色谱 柱柱效下降对最终检测结果的影响,特别适合大批量样品的检测。