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HPLC-ELSD法同时测定补血生乳颗粒中8种成分

导读:建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法同时测定补血生乳颗粒中的黄芪甲苷、阿魏酸、芍药苷、甘草酸、王不留行黄酮苷、柚皮苷、新橙皮苷、桔梗皂苷 D 的方法。


返回列表 来源:未知 发布日期:2019-10-24 17:42【
补血生乳颗粒(Buxue Shengru Granules,BSG) 系从《古今中医效验秘方宝典》之“玉露饮”方加减 化裁而成,由黄芪、当归、白芍、茯苓、甘草、王不 留行、川芎、枳壳、桔梗 9 味中药组成,属原国家 中药三类新药(国药证字 Z0000082),主要用于气 血亏虚所致的产后缺乳病。BSG 方中黄芪味甘,性 微温,补气健脾、益气生血;当归性辛温、味甘, 既能补血和血,又能宣通气分,与黄芪配伍,能益 气生血,二药相伍既能气旺生血以化生乳汁,又能 益气通络以助乳汁的运行,故共为君药。白芍味苦 酸,性微寒养血敛阴,配伍当归为妇科补血要药, 茯苓、甘草健脾益气,助君药以资气血生化之源, 故共为方中臣药,上述君臣药能补气健脾生血化乳。 王不留行为冲任阳明之药,专走血分,性善通利, 行血通乳;川芎活血行气;枳壳行气顺气;3 药共 为佐药。桔梗载药上行为方中使药。

蒸发光散射检测器(evaporative light-scattering detector,ELSD)是一种通用型检测器,主要针对 非或弱挥发成分进行检测,并可适用于梯度洗脱而 成为示差折光检测器的替代检测器。尽管其灵敏度 低于二极管阵列检测器(DAD),但有利于复杂样 品分析时谱图的简化,进而提高定量分析的抗干扰 能力。根据各成分的药理活性,结合《中国药 典》2015 年版对于单味中药的质量标准,当归、 川芎的指标成分阿魏酸,白芍的指标成分芍药苷, 甘草的指标成分甘草苷,枳壳的指标成分柚皮苷和 新橙皮苷,桔梗的指标成分桔梗皂苷 D,王不留行 的指标成分王不留行黄酮苷,确定采用 8 种成分控 制该中成药的质量。因此,本实验从多种有效成分 同时监控的角度出发,建立一种 HPLC-ELSD 法同 时测定 BSG 中 8 种成分,以期更为全面客观地评价 BSG 的质量。

1 仪器与材料
1.1 仪器
北分瑞利高效液相色谱仪,带 LTII ELSD,北京北分瑞利分析仪器集团公司;KQ5200B 型超声波清洗器, 昆山市超声仪器有限公司;MS205DU 型电子天平, 0.01 mg,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司; ATX224 型电子天平,0.1 mg,日本岛津公司。

1.2 试药
对照品王不留行黄酮苷(批号 111853-201704, 质量分数 96.9%)、芍药苷(批号 110736-201842, 质量分数 97.4%)、阿魏酸(批号 110773-201614, 质量分数 99.0%)、新橙皮苷(批号 111857-201703, 质量分数99.2%)、桔梗皂苷D(批号111851-201708, 质量分数 97.9%)、黄芪甲苷(批号 110781-201616, 质量分数 97.4%)均购自中国食品药品检定研究院; 对照品甘草酸(批号 MUST-18060805,质量分数 99.65%)购于成都曼思特生物科技有限公司;对照 品柚皮苷(批号 B0002972,质量分数 93.0%)购于 北京曼哈格生物科技有限公司。甲醇为分析纯,甲 酸、乙腈为色谱纯,国药集团化学试剂有限公司; 水为超纯水。BSG 由九芝堂股份有限公司提供,批 号 20180401、20180402、20180507、20180508、 20180602、20180603。

2 方法与结果
溶液的制备
对照品溶液的制备 精密称取各对照品适 量,加甲醇制成分别含王不留行黄酮苷 2.500 mg/mL、芍药苷 2.500 mg/mL、阿魏酸 2.500 mg/mL、 柚皮苷 2.500 mg/mL、新橙皮苷 2.500 mg/mL、桔梗 皂苷 D 2.500 mg/mL、黄芪甲苷 2.500 mg/mL、甘草 酸 2.500 mg/mL 的溶液,即得对照品溶液。
阴性对照溶液的制备 按 BSG 处方和工艺 分别制备缺黄芪、缺当归和川芎、缺白芍、缺甘草、 缺王不留行、缺枳壳、缺桔梗的阴性对照样品,按 照“2.1.2”项方法制备各阴性对照溶液。

稳定性试验
取经“ 2.1.2 ”项方法制备的样品(批号 20180401)供试品溶液,按照“2.2”项下的色谱条 件进行分析,采用 0、2、6、12、18 h 不同时间点 进样分析,进样量 10 μL,以王不留行黄酮苷、芍 药苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、桔梗皂苷 D、 黄芪甲苷、甘草酸的峰面积 RSD 值分别为 0.98%、 1.84%、1.56%、1.73%、1.55%、2.40%、1.81%、2.86%, 结果表明供试品溶液在18 h内色谱峰峰面积变化较 少,稳定性良好。

样品含量测定
取 6 批颗粒,按“2.1.2”项方法制备供试品溶 液,在“2.2”项下的液相色谱条件下进行测定,计 算含量。6 批次 BSG 中王不留行黄酮 苷、芍药苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、桔梗皂 苷 D、黄芪甲苷、甘草酸质量分数分别为 0.550 7~ 0.584 3、19.657 9~19.952 1、0.350 5~0.384 7、 18.794 7~19.557 3、12.124 7~12.414 2、0.610 7~ 0.631 3、0.238 8~0.274 3、2.750 4~2.852 2 mg/g, 结果表明BSG各批次之间8种主要成分的含量基本定。

3 讨论
3.1 色谱条件的考察
由于 BSG 中成分种类复杂,其中黄芪甲苷和桔 梗皂苷 D 在紫外区为末端吸收,而王不留行黄酮苷 和芍药苷色谱行为类似,分离较为困难。经多次反 复摸索,故本实验最终采用 0.1%甲酸水溶液-乙腈 作为流动相,在 C18 色谱柱上进行梯度洗脱,使用 蒸发光检测器进行检测,对照品溶液中 8 个目标色 谱峰的峰形良好,拖尾因子和分离度均符合定量技 术要求。因样品批次所限,6 批样品在该色谱条件 下,部分色谱峰(如王不留行黄酮苷、阿魏酸、桔梗皂苷 D、黄芪甲苷)响应值偏低,故本课题组将 进一步积累样品批次数据以优化色谱条件。

3.2 样品前处理的考察
在样品前处理优化中,分别采用乙腈、甲醇及 50%甲醇溶液对 BSG 样品进行了提取比较。结果表 明,乙腈作为提取溶剂时,8 个成分的提取效率非 常低,有些成分甚至在色谱条件下无法检测,可能 为各成分溶解度差异所致。采用 50%甲醇溶液提取 时,其色谱图比甲醇提取的更为复杂,且存在较多 影响目标色谱峰的干扰峰,不利于定量分析。因此, 选择甲醇作为最终的提取溶剂。

3.3 色谱柱的考察
本 实 验 考 察 了 2 种 不 同 品 牌 的 色 谱 柱 [Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)和 Hypersil C18 ODS,(250 mm×4.6 mm,5 μm)],结果使用 后者时王不留行黄酮苷和芍药苷的色谱峰分离度较 差,而使用前者则分离度良好。该结果表明在该色 谱条件下,采用不同的色谱柱可能会影响到色谱峰 的分离度,本课题组将在今后研究工作中进一步扩 大色谱柱的考察范围,以确认该方法的耐用性。

3.4 结论
本实验建立 HPLC-ELSD 法同时测定BSG中黄 芪甲苷、阿魏酸、芍药苷、甘草酸、王不留行黄酮 苷、柚皮苷、新橙皮苷、桔梗皂苷 D 的含量,该方 法简便、快速、准确,对全面控制该制剂质量具有 指导意义。