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顶空-气相色谱法测定丁酸梭菌发酵液中短链脂肪

导读:短链脂肪酸是丁酸梭菌生长代谢过程中的重要产物,是肠道内发生益生作用的主要物质之一。利用顶空 - 气相色谱( HS - GC) 内标法测定短链脂肪酸,对该方法进行了方法学验证,并测


返回列表 来源:未知 发布日期:2019-12-24 16:48【
丁酸梭菌( Clostridium butyricum) 在厌氧发酵过 程中会产生一系列的短链脂肪酸( SCFAs) ,其代谢 产物主要为丁酸和丁醇,乙酸和丙酮是副产物,还有 少量的乳酸和乙醇产生。丁酸梭菌在肠道内定 植后,主要代谢产生乙酸、丁酸和琥珀酸等,90% 以上的 SCFAs 通过质子化和阴离子扩散的方式被 肠上皮细胞吸收,只有 5% ~ 10% 被排泄到体外。 SCFAs 不仅可以降低肠道 pH,抑制有害菌的生长, 还可以作为肠上皮细胞能量代谢和生长发育的重要 能量来源,维持肠道健康。SCFAs 中的丁酸可以作 为配体激活特异性 G 蛋白偶联受体,激活肠黏膜免 疫活性,在一定程度上起到增强免疫力的作用。 因此,丁酸梭菌发酵过程中的代谢产物及其功能作 用受到广泛关注。
在测定生物样品中的短链成分时具有独特 的优势,避免了非挥发性组分对分析造成的干扰,减 少了对色谱柱及进样口的污染,在很大程度上弥 补了以上方法的缺陷。本文建立了 HS - GC 分析丁 酸梭菌发酵液中 SCFAs 的方法并进行了方法学验 证,以期为生物样品中 SCFAs 的测定提供参考。

 材料与方法
试验材料
丁酸梭菌; 乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、己酸 和2 - 乙基丁酸均为色谱纯,购自德国 Dr. Ehrenstorfer 公司。
北分瑞利2020气相色谱仪,配备氢火焰 离子化检 测 器( FID) ; HS - 10 顶空自动进样器; Rtx - Wax 弹性石英毛细管色谱柱 ( 30 m × 0. 25 mm,0. 25 μm) 。

试验方法
1. 2. 1 标准溶液的配制 分别精确称取乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸和 己酸标准品,纯水定容,配制成 200 mmol /L 的乙酸、 异丁酸、丁酸标准储备液,100 mmol /L 的丙酸、戊酸 和己酸标准储备液,备用。 分别移取不同体积的标准储备液,配制成混合 标准品溶液,其中,乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸和 己酸的终浓度均为 20 mmol /L。将标准品混合溶液 用纯水梯度稀释成不同浓度,在各浓度混合标准品 溶液中加入内标物 2 - 乙基丁酸,使内标物浓度均 为 1 mmol /L。
1. 2. 2 丁酸梭菌发酵液的制备 将活化后的丁酸梭菌,按 3% 的接种量接入发 酵培养基中,37 ℃下厌氧培养。每隔 2 h 取样,样液 在5 000 r/min、室温下离心10 min,将上清液与甲酸 以 100∶ 1 的体积比混合均匀后取 1 mL 移入顶空进 样瓶中,同时加入内标 2 - 乙基丁酸,加盖密封, 待测。

方法学验证
1. 2. 4. 1 标准曲线线性回归方程与检测范围确定 取
1. 2. 1 中梯度稀释的标准品溶液,分别进行 GC 测定。以标准品浓度为横坐标,不同浓度下标 准品的峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标绘制 标准曲线,并进行拟合得线性回归方程。
1. 2. 4. 2 日内精密度及日间精密度考察 日内精密度为在同一天内,取同一批分析样品 每隔 2 h 测定 1 次,每天连续测定 6 次。日间精密 度为同一样品连续 3 d 进行 GC 测定分析。通过计 算各 SCFAs 色谱峰的保留时间和峰面积的 RSD 判 断方法的精密度是否符合要求。
1. 2. 4. 3 稳定性考察 将已知浓度的 SCFAs 混合标准品溶液在 4 ℃下 存放,连续 3 d 取样,在室温下进行 GC 分析,考察溶 液在 3 d 内的稳定性。
1. 2. 4. 4 样品加标回收率考察 取 20 h 发酵液样品,测定其中 SCFAs 浓度后, 分别在发酵液中加入低、中、高 3 个不同浓度的混合 标准品溶液,其中低浓度的加入量为样品测定浓度 的 80% ,中浓度的加入量与样品测定浓度相近,高 浓度的加入量为样品测定浓度的 120% ,按下式计 算加标回收率。

易挥发的性质导致样品定量不 准确、重复性差,同时杂质的存在也会影响样品峰形 及基线稳定。在相关文献报道中,北分瑞利工厂采用 同时蒸馏萃取法提取了花生粕混合菌发酵物的短链 物质,并使用带有普通进样器的气相色谱仪进行短 链物质的测定。结果显示,经过同时蒸馏萃取的短 链物质较少,在样品中只检测到少量乙醇,可能的原 因是前处理损耗了较多的短链成分,另外蒸馏萃取 过程中带有的杂质导致峰形较差并且出峰不明显。 使用乙酸乙酯萃取大肠杆菌发酵液中的 SCFAs,建立了气相色谱分析方法,各 SCFAs 之间分 离度较好,但由于前处理采用有机溶剂萃取法,在前 处理过程中无法避免 SCFAs 的损失,线性相关系数 未能大于 0. 999,同时由于采用乙酸乙酯作为萃取 剂,气相色谱分析过程中会出现较强的溶剂峰,在干 扰色谱分析准确性的同时,也产生一定的基质效应。 本研究中使用的顶空 - 气相色谱分析简化了前处理 过程,减少了样品中 SCFAs 在前处理过程中的损 失,最大程度地保留了原始组分,检测结果更加接近 样品中的真实成分,相比于普通进样分析准确度有 所提升,顶空进样器在避免溶剂峰对分析干扰的同 时,也有效减少了有机溶剂对气相色谱系统的污染, 降低了维护成本。检测结果也显示各标品曲线的线 性关系良好,相应浓度范围相关系数均大于 0. 999。 方法学验证显示本研究建立的方法重复性好、稳定 度高。此外,北分瑞利分析仪器研究在对植物油中 SCFAs 含量 分析时所用时间为 26 min,对益生菌发酵产 物中 SCFAs 含量分析所用时间为 20. 5 min,而使用 顶空进样器进行 SCFAs 含量的测定,分析时间为 16 min,明显缩短了分析测定总时间,且无需样品前处 理,在大批量、快速检测应用方面具有明显的优势, 适用于发酵液中 SCFAs 快速测定。

 结 论
采用顶空 - 气相色谱法分析丁酸梭菌发酵液中 SCFAs 的含量变化,该方法前处理简单,避免了有机 溶剂萃取过程对环境的污染和对操作人员的危害, 色谱峰分离效果好,重复性好,具有快速、准确和稳 定性高的特点。所建立的方法适用于丁酸梭菌发酵 过程中 SCFAs 含量的快速测定。