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前处理法联合气相色谱串联质谱检测法快速定量

导读:该文建立了同时定量分析甘草药材和饮片中重点监控的典型有机氯、有机磷和菊酯类 34 种农药残留的方法,并对不同产地的甘草样品农残现状进行分析。通过乙腈提取,采用优化后 Qu


返回列表 来源:未知 发布日期:2019-12-16 15:05【
甘草为豆科甘草属多年生草本植物,主要分布在我国西北、华北、东北、新疆等地区。甘草药用 部位是根及根茎,性平,味甘,归脾胃肺经,具有补脾益气,清热解毒,缓急止痛,抗癌,调和诸药 等作用。甘草不仅有着巨大的药用价值,其在食品上的价值也逐渐被开发出来,它的甜度是甘蔗 的百倍,被大量作为食品添加剂。近年来甘草在国内外的需求更加巨大,导致甘草品质、安全与生产 之间的矛盾愈加突出,病虫害影响其产量和品质。各种农药的使用可能导致农药残留的问题,主要包 括有机磷类、有机氯类、菊酯类等。如今农药种类越来越多,除了禁用的农药外,有机磷和菊酯类等 农药的混合使用以用于除虫杀菌的同时进行。而在 20 世纪 60~70 年代有机氯类(OCPs)曾广泛使用, 由于其毒性大,残效期长,我国及世界各国已陆续禁止其使用,但由于有机氯农药化学性质稳定,难 氧化、难分解,在环境中可长期存留,其通过土壤或灌溉水污染作物,使在一些中药中仍有有机氯被 检出。随着人们安全意识的提升,农药残留已然成为全国乃至全世界人们关注的焦点。由于甘草易于 感染锈病褐斑病蚜虫,红蜘蛛等虫害,使有机磷、菊酯等杀虫剂等农药成为解决病虫害的主要手段。另外,甘草通常是 3 年采收,且药用部位是根类,更易受到土壤、水环境中残留有机氯的影 响。所以,建立甘草药材及饮片中的有机磷、有机氯、菊酯等农药的筛查方法为保证用药安全具有重 要的意义。

甘草中化学成分复杂,主要含有三萜类,如甘草甜素、甘草皂苷等,同时还含黄酮类成分、生物 碱类成分、香豆精类成分、水溶性多糖以及部分果胶等。气相色谱质谱联用法(GC-MS/MS)灵敏度 高、抗干扰能力强,具有出色的选择性,适合复杂样品的多物质检测,并且串联质谱采用多反应监测 模式(MRM),相比选择离子扫描(SIM),可以更准确的定性定量分析筛查。目前已报道的传统农残 检测前处理方法如索氏提取、固液萃取等,其重复性较低,且操作繁琐,耗时长。随着科技发展和仪 器设备的逐渐成熟,近年来出现的一些新兴前处理技术广泛应用于农残检测研究中,如固相萃取、固 相微萃取、QuEChERS 法和超临界流体萃取法等[5]。据文献报道,甘草的农残检测主要集中在单独测 定有机氯、有机磷、或同时测定有机氯和菊酯类,以及同时测定有机氯、有机磷和菊酯类农药 中的某几种农药[8]。《中国药典》2015 年版一部重点监控的有机氯类、有机磷及菊酯类农药均采用不 同的前处理和检测方法,即便是同时检测,本研究预实验显示其 QuEChERS 前处理方法并不适用, 因此,建立适宜的前处理和检测方法同时定量检测甘草药材及饮片中的重点监控的上述多农药残留, 在保障甘草用药安全方面具有重要意义。 本文针对《中国药典》2015 年版四部重点监控有机氯、有机磷及菊酯类农药品种,优化药典的 QuEChERS 前处理法,建立了优化后 QuEChERS 联合 GC-MS/MS 法高效、快速同时测定甘草中 34 种农药残留。该方法各项技术指标均满足检测要求,为甘草中 3 类农药残留同时检测提供可行方法。

1.材料
 气相色谱-三重四极杆串联质谱仪(北京北分瑞利分析仪器集团);NV-15G 氮吹仪(美国 Agela 公司);SF-TGL-20A 高速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司);AB135-S 电子天平 (Mettler-Toledo 公司);WH-861 型涡旋混合器(江苏太仓华利达公司);ZD-9556 水平摇床(太仓 市科教器材厂);Eppendorf 可调移液枪(德国 Eppendorf 公司);乙腈(色谱纯)(美国 Fisher034 种农药对照品均购于农业部环境保护科研监测所,质量浓度为 100 μg·mL-1 ;乙腈;无水硫酸 镁、氯化钠;N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)、十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)和硅胶(天津艾杰尔公 司)。 甘草样品 32 批来自于新疆、甘肃和内蒙古,样品均经中国医学科学院药用植物研究所杨美华研究 员鉴定,包括 16 批甘草药材,16 批甘草饮片。

2 方法
2.1 气相色谱条件
HP-5MS 石英毛细管柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm);载气:氦气(纯度≥99.999%);进样口温度 280 ℃;柱温:初始温度 60 ℃,以 40 ℃·min-1 程序升温至 120 ℃,以 5 ℃·min-1 程序升温至 310 ℃;流速 1.2 mL·min-1,进样量 1 μL;进样方式:不分流进样。

2.2 质谱条件
离子源:电子轰击电离源(EI 源);电压为 70 eV;离子源温度 230 ℃;接口温度 280 ℃;溶剂延 迟 时 间 4 min ;碰撞气体 : 氮 气 ( 纯 度 ≥ 99.999%) ; 工作站 为 Mass Hunter software (version B.07.01SP1)。

2.3 对照品储备液的制备
精密吸取甲胺磷、敌敌畏、α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、乐果、六氯苯、五氯硝基苯、二 嗪农、甲基对硫磷、马拉硫磷、对硫磷、七氯、艾氏剂、杀扑磷、p,p′-DDE、o,p′-DDD、p,p′-DDD、 o,p′-DDT、p,p′-DDT、乙硫磷、顺-环氧七氯、氧化氯丹、反-环氧七氯、反氯丹、β-硫丹、顺-氯丹、 狄氏剂、异狄氏剂、α-硫丹、硫丹硫酸盐、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯标准物质溶液各 20 μL, 用乙腈定容至 1 mL,制备成质量浓度为 2 μg·mL-1的混合对照品储备液。

2.4 供试品溶液的制备
精密称取过 3 号筛的药材样品粉末 3.0 g,置于 50 mL 聚苯乙烯具塞离心管中,加入 10.0 mL 水 和 15.0 mL 乙腈,涡旋混匀,于振荡器上振荡 5 min,加入 7.5 g 经制备的无水 MgSO4与 NaCl 混合粉 末(4:1),立即摇散后置振荡器上振荡 5 min 后,于离心机中离心 5 min(8 000 r·min-1 ),取上清液 9 mL 置于已装有净化剂的离心管(无水 MgSO4 900 mg,PSA 300 mg,C18 300 mg,硅胶 300 mg)中涡 旋,混匀,于振荡器上振荡 5 min,使净化剂与提取液充分混匀,再次离心 5 min(8 000 r·min-1), 精密称取 5 mL 上清液于 10 mL 离心管中,置于氮吹仪上在 40 ℃水浴浓缩至约 0.5 mL,采用乙腈定 容至 1 mL,涡旋混匀,制得溶液通过微孔滤膜(0.22 μm),即得。

3 结果与分析
3.1 质谱条件优化 取农药标准溶液在 m/z 50~500 进行全扫描,使用 NIST 标准库匹配检索,确证目标物的保留时间 和特征离子碎片。创建不同碰撞能量方法,获得在不同碰撞能量下的子离子扫描数据,选取最佳的碰 撞能量。在确定保留时间、离子对和碰撞能量的基础上以化合物的保留时间为中心,调整向前和向后 扫描时间长度,当单位时间内组分流出较多时可适当缩短扫描时间长度,使得离子对驻留时间延长, 进而改善峰形,提高灵敏度。

3.2 前处理方法优化
北分瑞利研究以《中国药典》2015 年版四部农药残留测定法中规定的中药多农残检测样品制备方法进 行预试验[10],结果显示,由于甘草成分复杂,经净化氮吹浓缩后得到的待测液颜色呈现橙黄色,有明 显橘红色油脂粒分散在液体底部,无法上机检测。为了解决这一问题,本研究对甘草药材的提取和净 化进行了优化。乙腈作为良好的提取溶剂,对于大多数农药具有很高的溶解性,本文中待测农药包括 有机氯、有机磷及拟除虫菊酯类,其极性分布弱极性至中等极性范围,尤其是弱极性化合物占 50%以 上,为了充分兼顾化合物的溶解度,采用提取溶剂中提高乙腈含量,由药典中水与乙腈体积比 1:1 提 高至 2:3。由于甘草共萃取液中可能含有低聚糖,黄酮类以及糖类等,降低水的比例,有助于降低此 类杂质的溶出。然后再加入无水 MgSO4和 NaCl 粉末(MgSO4与 NaCl 比例为 4:1)7.5 g,提高溶液盐浓 度,同时有利于离心后水层和有机层分层,有助于样品杂质的分离和净化。汇总文献已报道的甘草农 残检测前处理技术、操作、耗时及与检测器的匹配程度,本研究针对甘草基质、多农残、宽 极性范围信息的对比显示:文献已报道过的甘草前处理方法存在耗时长、繁琐操作如需静置、超声、 重复收集等处理,因此本研究通过优化 QuEChERS 法拟获得快捷省时且适用于甘草中多农残的同时 检测的前处理和检测方法。

4 结论
北分瑞利优化了 QuEChERs 前处理法,通过实验对比,建立了适用于甘草中典型有机氯、有机磷和菊 酯类多农残检测的气相色谱质谱联用法,结果表明所测定农药线性良好,定量限均低于药典农残限量 标准。实验证明甘草中基质成分复杂,存在较为严重的基质效应,经过方法优化基质效应得到一定程 度的补偿,所有农药均符合方法学考察。农药在气相色谱中出峰时间以及灵敏度都不相同,特别是有 机磷、有机氯和菊酯类农药之间区别更明显,相比于凝胶渗透色谱法对甘草进行农残检测时需要超 声[8,23-24],固相萃取等方法需要多次洗脱收集等操作[7],优化后的 QuEChERs 法操作简便、时间更 短,对于复杂基质的净化效果更好,同时该方法对于所检测农药残留具有很好的灵敏度,为甘草样品 日常多农残快速筛查和分析检测提供参考。另外,尽管甘草样品中有微量的有机氯和菊酯类农药检出,且均未超标,但仍需对其高度重视,以便保障其安全性。